苯胺类化合物手脚关节结构单位，大批存在于药物分子偏激他活性物资中，同期是多种工业材料制备的中枢中间体。透明度商场照管（TransparencyMarketResearch）发布的《2021-2031年各人苯胺繁衍物商场展望敷陈》显露，到2031年，各人苯胺类繁衍物的商场价值将达到110亿好意思元。因此，开发芳胺骨架的高效合澄净象在药物开发和材料科学等范围至关迫切。传统的苯胺类化合物的工业合成工艺主要以苯或其繁衍物开拔，通过苯环硝基化反映以及随后的硝基苯催化加氢赢得苯胺。在医药中间体合成范围，过渡金属催化的C–N键偶联反映相通被平日应用，这类现象的发展关于药物分子的构建具关连键真谛。尽管这些经典现象当今仍无可替代，科研责任者执续死力于探索愈加绿色和气、可执续的合成体系，从而最终幸免使用高温高压的反映条款，或者高本钱且具有生理毒性的过渡金属催化剂。本照管聚焦生物酶催化体系的开发，通过定向进化初步考据了该计谋合成苯胺类化合物的可行性。值得精细的是，相较于当然界中存在的基于P450体系的苯胺合成酶swag 肛交，这一世物催化体系展现出迥然相异的催化机制，为酶催化在苯胺合成范围的应用提供了新的破损标的。

4月7日，清华大学生物医学交叉照管院刘臻课题组在《德国应用化学》（AngewandteChemieInternationalEdition）发表了题为“氧化胺化合成苯胺的酶促平台”（AnEnzymaticPlatformforAnilineSynthesisthroughOxidativeAmination）的照管论文。通过雠校该推行室开发的黄素（FMN）依赖酶PtOYE（源自Parageobacillusthermantarcticus），这一催化体系不错灵验地将胺类化合物和环己酮繁衍物组合，通过氧化胺化的机制制备多种二级和三级苯胺。针对结构不同的胺类底物，照管东说念主员隔离通过两条定向进化旅途赢得了各自的上风突变体OYE_G3和OYE_M3，进步了酶催化的恶果并扼制了环己酮平直脱氢生成苯酚的副反映。通过多组能源学推行，照管东说念主员系统照管了这类苯胺合成酶的催化机制。推行标明，上风突变体不仅进步了亚胺中间体芳构化的催化恶果，且缩小了环己酮平直脱氢生成苯酚的活性，酿成了成心于诡计反映的协同效应。

图1.苯胺类化合物的生物合成新计谋

照管初期，照管东说念主员最先对野生型黄素酶偏激突变体的亚胺脱氢芳构化活性进行了系统性筛选。推行数据显露，课题组现存酶库中的OYE_G0突变体关于诡计反映具有显贵的运行活性，疏漏以最高的转动率（38%）催化生成诡计家具3aa且诡计家具与副家具4a的比例最优，体现了这类脱氢酶具有被进一步优化的后劲。

基于这一发现，照管东说念主员随后期骗OYE_G0手脚肇端模版，隔离针对二级苯胺和三级苯胺的合成经过进行了多轮卵白质工程化雠校与筛选。通过多个活性位点的定点宽裕突变以及立时突变，照管东说念主员最终隔离赢得催化合成二级苯胺的突变体OYE_G3以及催化合成三级苯胺的上风突变体OYE_M3。

图2.针对二级与三级苯胺隔离开展的卵白质工程化雠校

在细目了最优酶突变体和最适反映条款之后，照管东说念主员系统地照管了这些苯胺合成酶的底物适用范围。截止标明，这种生物催化现象展示出了精采的底物兼容性和官能团耐受性，不错将不同取代的苄胺、含杂环的伯胺以及部分烷基胺转动为相应的二级苯胺；也可得手地将部分仲胺转动为三级苯胺。此外，不同取代花样的环己酮也能参与反映。在此基础上，照管东说念主员登第多个底物进行了制备范畴的酶促反映，得手合成出如3ad、3ao等多种苯胺繁衍物，进一步考据了该现象的应用后劲。

图3.底物适用性拓展与部分放大磨真金不怕火

为了长远了解这一酶促反映的机理，照管东说念主员对生物催化脱氢偶联反映进行了一系列能源学照管。最先，照管东说念主员使用二级苯胺合成酶进化谱系中的各个变体针对3aa的酶催化合成进行了技能进度推行，并通过Michaelis-Menten弧线分析酶的能源学参数。推行截止标明定向进化引入的突变灵验地进步了苯胺合成酶OYE_G3的kcat。随后，照管东说念主员用近似的现象对三级苯胺3ca的合成反映进行了技能进度照管。与二级苯胺合成体系不同的是，三级苯胺合成反映的前期会发生可逆的aza-Michael加成经过酿成中间体6b，因此反映会显露出贯通的提醒期（inductionperiod）。为了明确斟酌酶活性是否从环己酮脱氢转念到亚胺脱氢，照管东说念主员相比了最先变体（OYE_G0）与定向进化谱系的两个最终变体（OYE_G3和OYE_M3）生成苯酚的活性变化（图4e和4f）。推行截止标明，进化后的变体关于苯酚生成经过的催化才智显贵下落。

图4.苯胺合成酶系统的能源学照管

图5.酶催化苯胺合成反映的推测经过

基于黄素依赖酶的独有脱氢催化机制，照管东说念主员开发了非自然的苯胺合成酶系统，不错灵验地制备二级与三级苯胺繁衍物。这种酶催化系统不错通事后续的进化进一步进步催化恶果，并通过谋划与推行招引的姿色完善机制照管。总体而言，这项责任为苯胺化合物的合成提供了高效、环境友好的生物合成计谋，在生物催化和药物开发等范围具有迫切的应用出路。

清华大学生物医学交叉照管院照管员刘臻为论文的通信作家swag 肛交，刘臻推行室连合培养博士生赵翔为论文的第一作家。照管得到科技部、清华大学生物医学交叉照管院以及北京人命科学照管所的赈济。